บทความนี้จะสอนวิธีเลือกคอลัมน์โครมาโตกราฟีของเหลว

โครมาโตกราฟีของเหลวเป็นวิธีการหลักในการทดสอบปริมาณของส่วนประกอบแต่ละส่วนและสิ่งเจือปนในวัตถุดิบ สารขั้นกลาง สารเตรียม และวัสดุบรรจุภัณฑ์ แต่สารหลายชนิดไม่มีวิธีการมาตรฐานที่ต้องพึ่งพา ดังนั้นจึงหลีกเลี่ยงไม่ได้ที่จะพัฒนาวิธีการใหม่ๆ ในการพัฒนาวิธีเฟสของเหลว คอลัมน์โครมาโตกราฟีเป็นแกนหลักของโครมาโตกราฟีของเหลว ดังนั้นวิธีการเลือกคอลัมน์โครมาโตกราฟีที่เหมาะสมจึงเป็นสิ่งสำคัญ ในบทความนี้ ผู้เขียนจะอธิบายวิธีเลือกคอลัมน์โครมาโตกราฟีของเหลวจากสามประเด็น ได้แก่ แนวคิดโดยรวม ข้อควรพิจารณา และขอบเขตการใช้งาน

A.แนวคิดโดยรวมสำหรับการเลือกคอลัมน์โครมาโทกราฟีของเหลว

1. ประเมินคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของสารวิเคราะห์ เช่น โครงสร้างทางเคมี ความสามารถในการละลาย ความคงตัว (เช่น ออกซิไดซ์/รีดิวซ์/ไฮโดรไลซ์ได้ง่ายหรือไม่) ความเป็นกรดและด่าง เป็นต้น โดยเฉพาะโครงสร้างทางเคมีเป็นกุญแจสำคัญ ปัจจัยในการกำหนดคุณสมบัติ เช่น หมู่คอนจูเกตมีการดูดซับรังสีอัลตราไวโอเลตที่แข็งแกร่งและการเรืองแสงที่รุนแรง

2. กำหนดวัตถุประสงค์ของการวิเคราะห์: จำเป็นต้องมีการแยกสูง, ประสิทธิภาพของคอลัมน์สูง, เวลาวิเคราะห์สั้น, ความไวสูง, ความต้านทานแรงดันสูง, อายุการใช้งานคอลัมน์ยาว, ต้นทุนต่ำ ฯลฯ

1. เลือกคอลัมน์โครมาโตกราฟีที่เหมาะสม: ทำความเข้าใจองค์ประกอบ คุณสมบัติทางกายภาพและทางเคมีของตัวเติมโครมาโตกราฟี เช่น ขนาดอนุภาค ขนาดรูพรุน ความทนทานต่ออุณหภูมิ ความทนทานต่อ pH การดูดซับของสารวิเคราะห์ ฯลฯ

1. ข้อควรพิจารณาในการเลือกคอลัมน์โครมาโทกราฟีของเหลว

บทนี้จะกล่าวถึงปัจจัยที่ต้องพิจารณาเมื่อเลือกคอลัมน์โครมาโตกราฟีจากมุมมองของคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของคอลัมน์โครมาโตกราฟีเอง 2.1 เมทริกซ์ฟิลเลอร์

2.1.1 ซิลิกาเจลเมทริกซ์ เมทริกซ์ตัวเติมของคอลัมน์โครมาโทกราฟีของเหลวส่วนใหญ่คือซิลิกาเจล ฟิลเลอร์ประเภทนี้มีความบริสุทธิ์สูง ต้นทุนต่ำ มีความแข็งแรงเชิงกลสูง และง่ายต่อการปรับเปลี่ยนกลุ่ม (เช่น พันธะฟีนิล พันธะอะมิโน พันธะไซยาโน ฯลฯ) แต่ค่า pH และช่วงอุณหภูมิที่ทนได้นั้นมีจำกัด: ช่วง pH ของตัวเติมเมทริกซ์ซิลิกาเจลส่วนใหญ่อยู่ที่ 2 ถึง 8 แต่ช่วง pH ของเฟสพันธะซิลิกาเจลดัดแปลงพิเศษสามารถกว้างได้เท่ากับ 1.5 ถึง 10 และยังมีเฟสพันธะซิลิกาเจลดัดแปลงพิเศษซึ่งมีความเสถียรที่ pH ต่ำ เช่น Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18 ซึ่งมีความเสถียรที่ pH 1 ถึง 8; ขีดจำกัดอุณหภูมิด้านบนของเมทริกซ์ซิลิกาเจลคือปกติ 60 ℃ และคอลัมน์โครมาโตกราฟีบางคอลัมน์สามารถทนต่ออุณหภูมิ 40 ℃ที่ pH สูง

2.1.2 สารตัวเติมโพลีเมอร์เมทริกซ์ โพลีเมอร์ส่วนใหญ่เป็นโพลีสไตรีน-ไดไวนิลเบนซีนหรือโพลีเมทาคริเลต ข้อดีคือสามารถทนต่อช่วง pH ที่กว้าง โดยสามารถใช้ได้ในช่วง 1 ถึง 14 และทนทานต่ออุณหภูมิสูงได้ดีกว่า (สามารถสูงถึง 80 °C) เมื่อเปรียบเทียบกับสารตัวเติม C18 ที่ใช้ซิลิกา สารตัวเติมประเภทนี้มีคุณสมบัติในการไม่ชอบน้ำได้ดีกว่า และโพลีเมอร์ที่มีรูพรุนขนาดใหญ่มีประสิทธิภาพมากในการแยกตัวอย่าง เช่น โปรตีน ข้อเสียคือประสิทธิภาพของคอลัมน์ต่ำกว่าและความแข็งแรงเชิงกลต่ำกว่าฟิลเลอร์ที่ใช้ซิลิกา 2.2 รูปร่างของอนุภาค

สารตัวเติม HPLC ที่ทันสมัยส่วนใหญ่เป็นอนุภาคทรงกลม แต่บางครั้งก็เป็นอนุภาคที่ไม่สม่ำเสมอ อนุภาคทรงกลมสามารถให้ความดันคอลัมน์ที่ต่ำกว่า ประสิทธิภาพของคอลัมน์ที่สูงขึ้น ความเสถียร และอายุการใช้งานที่ยาวนานขึ้น เมื่อใช้เฟสเคลื่อนที่ที่มีความหนืดสูง (เช่นกรดฟอสฟอริก) หรือเมื่อสารละลายตัวอย่างมีความหนืด อนุภาคที่ผิดปกติจะมีพื้นที่ผิวจำเพาะที่ใหญ่กว่า ซึ่งเอื้อต่อการดำเนินการเต็มรูปแบบของทั้งสองเฟส และราคาค่อนข้างต่ำ 2.3 ขนาดอนุภาค

ยิ่งขนาดอนุภาคเล็กลง ประสิทธิภาพของคอลัมน์ก็จะยิ่งสูงขึ้นและการแยกตัวก็จะยิ่งสูงขึ้น แต่ความต้านทานแรงดันสูงก็จะยิ่งแย่ลง คอลัมน์ที่ใช้กันมากที่สุดคือคอลัมน์ขนาดอนุภาค 5 μm; หากข้อกำหนดในการแยกสูง สามารถเลือกตัวเติมขนาด 1.5-3 μm ได้ ซึ่งเอื้อต่อการแก้ปัญหาการแยกตัวของตัวอย่างเมทริกซ์ที่ซับซ้อนและตัวอย่างที่มีหลายองค์ประกอบ UPLC สามารถใช้ฟิลเลอร์ 1.5 μm; ตัวเติมขนาดอนุภาค 10 μm ขึ้นไปมักใช้สำหรับคอลัมน์กึ่งเตรียมการหรือคอลัมน์เตรียมการ 2.4 ปริมาณคาร์บอน

ปริมาณคาร์บอนหมายถึงสัดส่วนของเฟสที่ถูกพันธะบนพื้นผิวของซิลิกาเจล ซึ่งสัมพันธ์กับพื้นที่ผิวจำเพาะและความครอบคลุมของเฟสที่ถูกพันธะ ปริมาณคาร์บอนสูงให้ความจุคอลัมน์สูงและมีความละเอียดสูง และมักใช้กับตัวอย่างที่ซับซ้อนซึ่งต้องมีการแยกตัวสูง แต่เนื่องจากเวลาปฏิสัมพันธ์ระหว่างสองเฟสยาวนาน เวลาในการวิเคราะห์จึงยาวนาน คอลัมน์โครมาโตกราฟีที่มีปริมาณคาร์บอนต่ำมีเวลาการวิเคราะห์ที่สั้นกว่าและสามารถแสดงการเลือกสรรที่แตกต่างกัน และมักใช้กับตัวอย่างง่ายๆ ที่ต้องการการวิเคราะห์อย่างรวดเร็วและตัวอย่างที่ต้องมีสภาวะเฟสที่เป็นน้ำสูง โดยทั่วไปปริมาณคาร์บอนของ C18 จะอยู่ระหว่าง 7% ถึง 19% 2.5 ขนาดรูพรุนและพื้นที่ผิวจำเพาะ

ตัวกลางดูดซับของ HPLC เป็นอนุภาคที่มีรูพรุน และปฏิกิริยาส่วนใหญ่เกิดขึ้นในรูขุมขน ดังนั้นโมเลกุลจึงต้องเข้าไปในรูพรุนจึงจะดูดซับและแยกออกจากกัน

ขนาดรูพรุนและพื้นที่ผิวจำเพาะเป็นสองแนวคิดที่เสริมกัน ขนาดรูพรุนเล็กหมายถึงพื้นที่ผิวจำเพาะขนาดใหญ่ และในทางกลับกัน พื้นที่ผิวจำเพาะขนาดใหญ่สามารถเพิ่มปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลของตัวอย่างและเฟสที่ถูกพันธะ เพิ่มการกักเก็บ เพิ่มการโหลดตัวอย่างและความจุของคอลัมน์ และการแยกส่วนประกอบที่ซับซ้อน ฟิลเลอร์ที่มีรูพรุนเต็มที่เป็นของฟิลเลอร์ประเภทนี้ สำหรับผู้ที่มีข้อกำหนดการแยกสูง แนะนำให้เลือกฟิลเลอร์ที่มีพื้นที่ผิวจำเพาะขนาดใหญ่ พื้นที่ผิวจำเพาะขนาดเล็กสามารถลดแรงกดต้าน ปรับปรุงประสิทธิภาพของคอลัมน์ และลดเวลาสมดุล ซึ่งเหมาะสำหรับการวิเคราะห์การไล่ระดับสี ฟิลเลอร์แกนกลางเป็นของฟิลเลอร์ประเภทนี้ เพื่อให้มั่นใจถึงการแยกส่วน ขอแนะนำให้เลือกฟิลเลอร์ที่มีพื้นที่ผิวจำเพาะขนาดเล็กสำหรับผู้ที่ต้องการประสิทธิภาพการวิเคราะห์สูง 2.6 ปริมาตรรูพรุนและความแข็งแรงทางกล

ปริมาตรรูพรุนหรือที่เรียกว่า "ปริมาตรรูพรุน" หมายถึงขนาดของปริมาตรช่องว่างต่อหน่วยอนุภาค สามารถสะท้อนความแข็งแรงทางกลของฟิลเลอร์ได้ดี ความแข็งแรงเชิงกลของฟิลเลอร์ที่มีปริมาตรรูพรุนมากจะอ่อนกว่าฟิลเลอร์ที่มีปริมาตรรูพรุนเล็กน้อยเล็กน้อย สารตัวเติมที่มีปริมาตรรูพรุนน้อยกว่าหรือเท่ากับ 1.5 มล./กรัมส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการแยก HPLC ในขณะที่สารตัวเติมที่มีปริมาตรรูพรุนมากกว่า 1.5 มล./กรัมส่วนใหญ่จะใช้สำหรับโครมาโทกราฟีแบบแยกโมเลกุลและโครมาโทกราฟีความดันต่ำ 2.7 อัตราการกำหนดสูงสุด

การปิดฝาสามารถลดยอดหางที่เกิดจากปฏิสัมพันธ์ระหว่างสารประกอบและหมู่ไซลานอลที่ถูกเปิดเผย (เช่น พันธะไอออนิกระหว่างสารประกอบอัลคาไลน์และหมู่ไซลานอล แรง van der Waals และพันธะไฮโดรเจนระหว่างสารประกอบที่เป็นกรดและหมู่ไซลานอล) จึงช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของคอลัมน์และรูปร่างสูงสุด . เฟสที่ถูกผูกมัดแบบไม่มีฝาปิดจะทำให้เกิดการคัดเลือกที่แตกต่างกันโดยสัมพันธ์กับเฟสที่ถูกผูกมัดแบบต่อยอด โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับตัวอย่างขั้วโลก

1. ขอบเขตการใช้งานคอลัมน์โครมาโทกราฟีของเหลวแบบต่างๆ

บทนี้จะอธิบายขอบเขตการใช้งานคอลัมน์โครมาโตกราฟีของเหลวประเภทต่างๆ ในบางกรณี

3.1 คอลัมน์โครมาโตกราฟี C18 แบบย้อนกลับเฟส

คอลัมน์ C18 เป็นคอลัมน์แบบกลับเฟสที่ใช้กันมากที่สุด ซึ่งสามารถตอบสนองการทดสอบเนื้อหาและความเจือปนของสารอินทรีย์ส่วนใหญ่ และสามารถใช้ได้กับสารที่มีขั้วปานกลาง มีขั้วอ่อน และไม่มีขั้ว ควรเลือกประเภทและข้อกำหนดของคอลัมน์โครมาโตกราฟี C18 ตามข้อกำหนดการแยกเฉพาะ ตัวอย่างเช่น สำหรับสารที่มีข้อกำหนดการแยกสารสูง มักใช้ข้อกำหนดเฉพาะ 5 μm*4.6 มม.*250 มม. สำหรับสารที่มีเมทริกซ์การแยกที่ซับซ้อนและมีขั้วที่คล้ายกัน สามารถใช้ข้อกำหนดเฉพาะ 4 μm*4.6 มม.*250 มม. หรือขนาดอนุภาคที่เล็กกว่าได้ ตัวอย่างเช่น ผู้เขียนใช้คอลัมน์ขนาด 3 μm*4.6 มม.*250 มม. เพื่อตรวจจับสิ่งเจือปนที่เป็นพิษต่อพันธุกรรมสองรายการใน celecoxib API การแยกสารทั้งสองสามารถทำได้ถึง 2.9 ซึ่งยอดเยี่ยมมาก นอกจากนี้ ภายใต้สมมติฐานของการรับประกันการแยก หากจำเป็นต้องวิเคราะห์อย่างรวดเร็ว มักจะเลือกคอลัมน์สั้น 10 มม. หรือ 15 มม. ตัวอย่างเช่น เมื่อผู้เขียนใช้ LC-MS/MS เพื่อตรวจจับสิ่งเจือปนที่เป็นพิษต่อพันธุกรรมในไพเพอราควิน ฟอสเฟต API จะใช้คอลัมน์ขนาด 3 μm*2.1 มม.*100 มม. การแยกระหว่างสิ่งเจือปนและส่วนประกอบหลักคือ 2.0 และการตรวจจับตัวอย่างสามารถทำได้เสร็จภายใน 5 นาที 3.2 คอลัมน์ฟีนิลเฟสกลับด้าน

คอลัมน์ฟีนิลยังเป็นคอลัมน์ประเภทย้อนกลับอีกด้วย คอลัมน์ประเภทนี้มีความสามารถในการคัดเลือกสารประกอบอะโรมาติกสูง หากการตอบสนองของสารประกอบอะโรมาติกที่วัดโดยคอลัมน์ C18 ธรรมดานั้นอ่อนแอ คุณสามารถพิจารณาเปลี่ยนคอลัมน์ฟีนิลได้ ตัวอย่างเช่น ตอนที่ฉันสร้าง celecoxib API การตอบสนองของส่วนประกอบหลักที่วัดโดยคอลัมน์ฟีนิลของผู้ผลิตรายเดียวกันและข้อกำหนดเดียวกัน (ทั้งหมด 5 μm*4.6 มม.*250 มม.) มีค่าประมาณ 7 เท่าของคอลัมน์ C18 3.3 คอลัมน์เฟสปกติ

เนื่องจากเป็นส่วนเสริมที่มีประสิทธิภาพสำหรับคอลัมน์แบบกลับเฟส คอลัมน์แบบเฟสปกติจึงเหมาะสำหรับสารประกอบที่มีขั้วสูง หากพีคยังเร็วมากเมื่อทำการชะด้วยเฟสที่เป็นน้ำมากกว่า 90% ในคอลัมน์เฟสย้อนกลับ และแม้จะใกล้เคียงและทับซ้อนกับพีคของตัวทำละลาย คุณสามารถพิจารณาเปลี่ยนคอลัมน์เฟสปกติได้ คอลัมน์ประเภทนี้ประกอบด้วยคอลัมน์ฮิลิค คอลัมน์อะมิโน คอลัมน์ไซยาโน ฯลฯ

3.3.1 คอลัมน์ Hilic คอลัมน์ Hilic มักจะฝังหมู่ที่ชอบน้ำไว้ในสายโซ่อัลคิลที่ถูกพันธะเพื่อเพิ่มการตอบสนองต่อสารที่มีขั้ว คอลัมน์ประเภทนี้เหมาะสำหรับการวิเคราะห์สารน้ำตาล ผู้เขียนใช้คอลัมน์ประเภทนี้เมื่อทำเนื้อหาและสารที่เกี่ยวข้องของไซโลสและอนุพันธ์ของไซโลส ไอโซเมอร์ของอนุพันธ์ไซโลสสามารถแยกออกจากกันได้ดีเช่นกัน

3.3.2 คอลัมน์อะมิโนและคอลัมน์ไซยาโน คอลัมน์อะมิโนและคอลัมน์ไซยาโนหมายถึงการแนะนำการดัดแปลงอะมิโนและไซยาโนที่ส่วนท้ายของสายโซ่อัลคิลที่ถูกพันธะตามลำดับ เพื่อปรับปรุงความสามารถในการเลือกสรรของสารพิเศษ ตัวอย่างเช่น คอลัมน์อะมิโนเป็นทางเลือกที่ดี สำหรับการแยกน้ำตาล กรดอะมิโน เบส และเอไมด์ คอลัมน์ไซยาโนมีความสามารถในการเลือกสรรที่ดีกว่าเมื่อแยกสารที่มีโครงสร้างคล้ายกันที่เติมไฮโดรเจนและที่ไม่เติมไฮโดรเจนเนื่องจากมีพันธะคอนจูเกต คอลัมน์อะมิโนและคอลัมน์ไซยาโนสามารถสลับระหว่างคอลัมน์เฟสปกติและคอลัมน์เฟสย้อนกลับได้ แต่ไม่แนะนำให้สลับบ่อยครั้ง 3.4 คอลัมน์ไครัล

คอลัมน์ Chiral ตามชื่อแนะนำ เหมาะสำหรับการแยกและการวิเคราะห์สารประกอบไครัล โดยเฉพาะในด้านเภสัชกรรม คอลัมน์ประเภทนี้สามารถพิจารณาได้เมื่อคอลัมน์เฟสย้อนกลับแบบธรรมดาและคอลัมน์เฟสปกติไม่สามารถแยกไอโซเมอร์ได้ ตัวอย่างเช่น ผู้เขียนใช้คอลัมน์ไครัลขนาด 5 μm*4.6 มม.*250 มม. เพื่อแยกไอโซเมอร์สองตัวของ 1,2-ไดฟีนิลเอทิลีนไดเอมีน: (1S, 2S)-1, 2-ไดฟีนิลเอทิลีนไดเอมีน และ (1R, 2R)-1, 2 -ไดฟีนิลเอทิลีนไดเอมีน และการแยกระหว่างทั้งสองมีค่าประมาณ 2.0 อย่างไรก็ตาม เสาไครัลมีราคาแพงกว่าเสาประเภทอื่นๆ ปกติคือ 1W+/ชิ้น หากมีความจำเป็นต้องใช้คอลัมน์ดังกล่าว หน่วยจะต้องมีงบประมาณเพียงพอ 3.5 คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน

คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนเหมาะสำหรับการแยกและการวิเคราะห์ไอออนที่มีประจุ เช่น ไอออน โปรตีน กรดนิวคลีอิก และสารน้ำตาลบางชนิด ตามประเภทของตัวเติม คอลัมน์เหล่านี้จะถูกแบ่งออกเป็นคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนบวก คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน และคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนบวกเข้มข้น

คอลัมน์แลกเปลี่ยนแคตไอออนประกอบด้วยคอลัมน์ที่มีแคลเซียมและไฮโดรเจน ซึ่งส่วนใหญ่เหมาะสำหรับการวิเคราะห์สารประจุบวก เช่น กรดอะมิโน ตัวอย่างเช่น ผู้เขียนใช้คอลัมน์ที่มีแคลเซียมเป็นหลักในการวิเคราะห์แคลเซียมกลูโคเนตและแคลเซียมอะซิเตตในสารละลายฟลัชชิ่ง สารทั้งสองมีการตอบสนองที่แข็งแกร่งที่ แลมบ์ดา = 210 นาโนเมตร และระดับการแยกถึง 3.0; ผู้เขียนใช้คอลัมน์ที่มีไฮโดรเจนในการวิเคราะห์สารที่เกี่ยวข้องกับกลูโคส สารหลักที่เกี่ยวข้องหลายชนิด ได้แก่ มอลโตส มอลโตไตรโอส และฟรุกโตส มีความไวสูงภายใต้เครื่องตรวจจับแบบดิฟเฟอเรนเชียล โดยมีขีดจำกัดการตรวจจับต่ำเพียง 0.5 ppm และระดับการแยกที่ 2.0-2.5

คอลัมน์แลกเปลี่ยนประจุลบส่วนใหญ่เหมาะสำหรับการวิเคราะห์สารประจุลบ เช่น กรดอินทรีย์และไอออนฮาโลเจน คอลัมน์แลกเปลี่ยนแคตไอออนเข้มข้นมีความสามารถในการแลกเปลี่ยนไอออนและความสามารถในการคัดเลือกสูงกว่า และเหมาะสำหรับการแยกและการวิเคราะห์ตัวอย่างที่ซับซ้อน

ข้อมูลข้างต้นเป็นเพียงการแนะนำประเภทและช่วงการใช้งานของคอลัมน์โครมาโทกราฟีของเหลวทั่วไปหลายๆ คอลัมน์ รวมกับประสบการณ์ของผู้เขียนเอง มีคอลัมน์โครมาโตกราฟีประเภทพิเศษอื่นๆ ในการใช้งานจริง เช่น คอลัมน์โครมาโตกราฟีที่มีรูพรุนขนาดใหญ่, คอลัมน์โครมาโทกราฟีที่มีรูพรุนขนาดเล็ก, คอลัมน์โครมาโตกราฟีแบบอัฟฟินิตี้, คอลัมน์โครมาโตกราฟีแบบมัลติโหมด, คอลัมน์โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงพิเศษ (UHPLC), คอลัมน์โครมาโตกราฟีของไหลวิกฤตยิ่งยวด ( SFC) ฯลฯ ซึ่งมีบทบาทสำคัญในด้านต่างๆ ควรเลือกคอลัมน์โครมาโตกราฟีประเภทเฉพาะตามโครงสร้างและคุณสมบัติของตัวอย่าง ข้อกำหนดในการแยก และวัตถุประสงค์อื่นๆ